Что вообще такое ПЦРы? Я их часто упоминаю, но все никак не объясню что это вообще такое.

И так! Я использую не просто ПЦР тесты а кПЦР, что расшифруется как “колличественная полимиеразная цепная реакция” и используется для амплификации сегмента ДНК. Звучит прикольно, но что это значит?

Для того чтобы это понять надо знать пару штучек о ДНК и как вообще работает генетика и хранение генетического материала. И так, ДНК представляет из себя двойную спираль, которая состоит из четырёх нуклеиновых оснований: Аденина (А), Тимина (Т), Гуанина (Г) и Цитозина (Ц). Эти основания находятся на разных нитях ДНК и спаиваются водородными связями по принципу комплиментарности между собой как А=Т и Г≡Ц. То есть если на одной нити у нас А, то комплементарно ему на другой нити будет Т (См. картинку). Именно в последовательности этих оснований кодируется генетический материал.

Для того чтобы его считать, необходимо разорвать водородные связи и сделать из двойной спиральки одиночную цепь. Для этого существует такая штука как хеликаза, фермент, который работает как ножницы и режет связи.
ДНК порвалась, что дальше? Дальше образуется вилка репликации, которая представляет из себя цепь ДНК, хеликазу и торчащие из нее концы одиночной ДНК. Их два: лидирующая и запаздывающая, и то как они считываются происходит немного по разному, но сейчас это не сильно важно. К концам подбегает кабанчиком праймаза, еще один фермент, и создает праймер- начало новой цепи ДНК. К праймеру уже присоединяется полимиераза и начинает лепить дальше по цепи комплементарные основания, начиная как раз таки с праймера.

Когда процесс заканчивается и все что нужно было слеплено, в дело вступает экзонуклеаза и удаляет праймеры, за их ненадобностью, ведь они служат скорее как флажки, показывающие где у цепи начало и где конец. Дырки оставшиеся от этого заполняются ДНК-полимиеразой. В итоге вилка начинает выглядеть уже не так куцо, и вместо одной порезаной ДНК у нас их уже почти что две целых. Осталось только отцепить их, свернуть в спиральку и готово. Для этого существует еще один фермент- лигаза. Итого на выходе у нас две спиральки ДНК. Половинка каждой спиральки когда-то была отдельной ДНК, а половинка была добавлена ферментами.

Весь этот процесс называется репликацией и нужен для передачи генетической информации . ПЦР тест повторяет этот процесс искусственно и с помощью перепадов температур и всяких добавочек. Подробнее про добавки чтобы к этому не возвращаться:

o SYBR Green- как раз тот химикат, которого у нас сейчас нет. Это основной компонент ПЦРов, без которого работать они не будут. Это флюориесцентный краситель, который окрашивает основания и благодаря ему, ПЦР анализатор понимает где что. Про это подробнее чуть пониже. А еще это канцероген, но не такой жуткий как бромистый этидий, который использовался для этих целей ранее. Он еще и мутаген, активируемый УФ излучением, ко всему прочему.

o Праймеры- так как ПЦР это искуственный процесс, и в нем мы рассматриваем необходимые участки ДНК, праймеры добавляются отдельно.

о Taq Полимераза- особая полимераза, которую добывают из бактерий, живущих в термальных источниках, потому что родная полимераза зачастую тупо не работает при высоких температурах.

Вся эта радость заливается в колодцы на пластинке (Вот на видео я это как раз таки и делаю!) вместе с комплиментарной ДНК. Что это такое и чем она отличается от обычной? Это укороченная версия обычной ДНК, которая была искусственно создана из матричной РНК с помощью реверсивной транскрипции. Если я начну еще и это объяснять, то пост получится просто бесконечно долгим, так что тут достаточно знать, что это просто кусок ДНК в котором присутствуют только фрагменты, которые реально что-то кодируют. Да, не во всей ДНК реально что-то закодированно, довольно много фрагментов вообще ничего не делают.

И так все это перемешивается в центрифуге (это она на видеве!) и отправляется в ПЦР-анализатор. Вот тут начинается магия науки.

Процесс, где ДНК рвут напополам называется денатурацией. В тесте она происходит не с помощью хеликазы, а путем нагревания всех-всех штук в пластинке до 95 градусов. Водородные связи рушатся, образуются две одиночные ДНК. Дальше начинается амплификация- обозначение того какой кусок ДНК мы хотим рассмотреть. Для этого как раз используются добавленные праймеры. Чтобы она началась и праймеры прилипли, анализатор остужается, до 60 градусов. Затем все снова нагревается, примерно до 65, и Taq полимиераза начинает формировать цепочки по принципу комплиметраности. То что я сейчас расписала- один цикл ПЦР. Для результата он повторяется раз тридцать, поэтому на выходе, так как каждый раз количество ДНК в пробирке удваивается, мы получаем нереально много копий одного и того же участка.

Что с этими копиями делать дальше? В кПЦР, котрый использую я, важны скорее не сами копии, а то как они образуются. Помните SYBR green? Вот тут он как раз таки и нужен. SYBR начинает светиться, когда связывается с ДНК. Причем исключительно с двухцепочной. Поэтому чем больше ДНК в пробирке, тем сильнее свет. Этот свет считывает датчик анализатора и делает график, возрастающий по экспоненте, по которому можно понять уровень экспрессии определенного гена.

А что вообще такое экспрессия гена? Про это будет еще вторая часть, чтобы не затягивать сильно, а то уже пост километровый :)

Я только рада вопросам и в принципе поговорить о биологии! Так что любой фидбек, как и предложения для постов, приветствуется

Как и репосты (*подмигивание*), у меня тут не просто научпоп контент а КОНТЕНТИЩЕ, над которым я действительно запариваюсь, чтобы все было понятно и правильно с научной точки зрения

Хотя мне иногда кажется, что мои объяснения сложных штук звучат примерно так, потому что мне уже сложновато понимать, что люди без биологического бэкграунда знают, а что нет

Блин день дурака на самом деле почти что мой профессиональный праздник. Очень много вещей по отношению к природе и животным, которые я делаю из чистого любопытства и энтузиазма, люди считывают как дурость

Ну кто как не биолог полезет объедать тёрн с куста например :))

Или проведет закат так